1、QIAGEN試劑盒抗體濃度須優(yōu)化
我們通常會(huì)follow師兄師姐留下來的操作步驟，但是如果試劑稍有不同，則可能需要優(yōu)化抗體的量。記住，非特異的抗體結(jié)合會(huì)增加背景。為了防止這一點(diǎn)，切勿使用過多的一抗或二抗。
2、QIAGEN試劑盒洗滌很關(guān)鍵
QIAGEN試劑盒洗滌步驟看似很無聊，其實(shí)很重要，因?yàn)槿绻唇Y(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測試劑)殘留在微孔板中，那么它會(huì)增加背景噪音。如有必要，可增加洗滌液中的鹽濃度，這會(huì)阻止非特異結(jié)合反應(yīng)。如果ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)背景過高，而您懷疑洗滌不夠時(shí)，可以嘗試增加洗滌次數(shù)。
3、QIAGEN試劑盒特異性因素
1.固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種，以微量滴定板zui為常見。
2.包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度。
3.包被抗體的效價(jià)。具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面。
4.封閉。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。
4、QIAGEN試劑盒實(shí)驗(yàn)封閉很重要
封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn)。這就降低了可產(chǎn)生信號(hào)的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會(huì)。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧。如果您的背景過高，懷疑封閉不充分，那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液，或適當(dāng)延長封閉時(shí)間。
如果您一直被背景問題所困擾，那么也許您該花些時(shí)間來優(yōu)化封閉液。這可能需要時(shí)間，但也是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液：蛋白和非離子型去污劑。您使用的類型須取決于多個(gè)因素，包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測試劑。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合，但它不應(yīng)當(dāng)與抗原、抗體或檢測試劑發(fā)生相互作用。zui常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩(wěn)定，在去除洗滌過程中的一些非特異結(jié)合上很有用。但它們只在存在時(shí)起作用，因?yàn)楹苋菀妆幌吹簟Ｒ虼怂邢礈煲褐幸脖仨毺砑臃忾]液。請勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%)，它會(huì)降低特異結(jié)合，產(chǎn)生假陰性。另一個(gè)選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液，后者可協(xié)助洗滌過程中的封閉。
蛋白封閉液則有所不同，是*的。它們與開放位點(diǎn)結(jié)合并封閉，同時(shí)穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚明膠。血清組分的內(nèi)在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用。不過，它的缺點(diǎn)在于能與Protein A和IgG抗體相互作用。解決這個(gè)問題的一種方法是使用雞或魚的正常血清。
5、QIAGEN試劑盒檢測試劑要適量
另一點(diǎn)也很顯而易見：切勿使用過多的檢測試劑。如果濃度過高，或者未正確稀釋，則會(huì)導(dǎo)致高背景。也不要顯色過度，如有必要，優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)加入終止液。
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